研究发现了冬虫夏草的生长状况

　　 冬虫夏草菌种的鉴定，除了使用原始的、传统的生物学鉴定外，使用近年来国内外科学家应用分子生物学技术(基因序列分析)――检测、比较RAPD和ITS序列分析，是菌种鉴定上的一大进展，为冬虫夏草与无性型菌种提供了可靠的科学的证据。中国科学院微生物所真菌地衣系统学重点实验室蒋毅博士和博士导师姚一建研究员归纳介绍了近年来冬虫夏草基因比较分析结果：青藏高原各产地的冬虫夏草之间的关系，冬虫夏草与虫草属的其他虫草关系以及冬虫夏草与无性型菌种的关系，很有价值。

 　　所以，把《虫草属分子系统学研究现状》全文编入本书。

 　　近年来的分子系统学研究结果表明：麦角菌目（Clavicipitales）与肉座菌目（Hypocreales）以及虫草属[Cordyceps(Fr.)Link]与麦角菌科(Clavicipitacese)内的有关种属关系密切，但虫草属为一多系群，其中只有新虫草亚属的种类形成单系群。虫草属种类的进化与寄主有一定的关系,有关研究显示它们在亲缘关系相差很大的寄主之间多次转移。

　　虫草属包括许多具有重要应用价值的种类,如药理作用明显的 冬虫夏草、古尼虫草 [Cordyceps gunnii (Beek.) Berk.]和蛹虫草[Cordyceps militaris (L.) Link]等[4]，以及在害虫防治上具有潜在生防价值的众多昆虫病原菌[5-8],该属菌物在医药、农业等行业上具有广阔的开发利用前景。

　　根据最近的分类系统， 虫草属隶属于子囊菌门( Ascomycita)、肉座菌目、麦角菌科。传统的形态分类主要根据子实体和寄主等特征,目前一般认为该属拥有300余种[8，11，12]，但从英国CABI Bioscience提供的菌物名称数据库上可检索到多达497个的虫草菌名称记录。

　　 虫草属是一个复杂的类群,在系统分类上还有许多问题尚未澄清。一方面,由于一些虫草菌在人工培养基上不易存活或不形成产孢结构，另有一些种类在培养基上则只产生无性型[16.17]，而无法观察到生活史的整个过程,所以造 成了多种虫草菌与其相应的无性型种类关系不明确。另一方面,该属菌物的寄主类群差别很大,大多数虫草菌寄生在昆虫上,少数种类寄生在蜘蛛甚至其他菌物或植物上,虫草种类与其寄主类群呈现十分复杂的关系。然而,这种划分是否反应了自然的系统关系,以及虫草属是否为一个单系群或具有多个起源等重要的系统学研究问题都有待澄清,而要解决这些问题,仅仅依靠传统分类的方法有很大的难度。

　　自20世纪80年代以来,应用分子生物学方法来探讨菌物的系统关系与进化逐渐成为明显的趋势。在虫草属研究上,主要采用了RFLP, RAPD和DNA片段序列分析等方法,并取得了较大的进展。本文就这方面的研究进行归纳,以期能对我国虫草属的分子系统学研究有所启示。

　　1 虫草属分子系统学研究现状

　　分子生物学方法在20世纪90年代初就已被用来研究虫草属的系统学地位,之后在属内组分、种类的相互关系、种下的遗传分化、有性型与无性型的关系等方面都有研究报道。这些工作所运用的试验和分析方法有很多共性,但针对不同的具体问题,方法也各有其特点。

　　1.1虫草属与其他相关类群的关系以及属内组成成分

　　包括有虫草属的麦角菌科在系统学研究上曾被认为是一个独立的目,即麦角菌目,对这个类群的系统学地位也有过很多讨论。虫草属的多数种类为昆虫寄生菌,有关的分子系统发育研究常常显示出虫草菌的进化与寄主有一定的关系。

 　　由于生活史的复杂性,虫草属菌物涉及到白僵菌属（Beauveria Vuill.）、拟青霉属(Paecilomyces Bainier )、轮枝孢属( Verticillium Nees), Akanthomyces Lebert属、Nomuraea Maubi.属，以及被毛孢属(Hirsutella Pat. )等多个无性型属的种类。但无性型属本身不一定就是由亲缘关系紧密的种类组成的类群,如上述这些属在进行系统学分析时显示出多元性的就有轮枝孢属和拟青霉属[37]。在分析虫草属与这些无性型属种关系的系统树上,常常是不同种类的虫草菌与这些无性型属的种类混合在一起形成同一分支[11，33]，而看不出整个属与某一无性型属形成特定的关系。

　　1.2 种间关系及其与寄主的联系

　　近年来,分子生物学方法包括蛋白结合图谱和DNA序列分析等已逐步应用于区分和研究虫草属内不同种类的关系。Sung等[39]在形态鉴定的基础上,对一些虫草种类进行了蛋白结合图谱分析,分支图上显示蛹虫草与Cordyceps roseostromata Kobayasi & Shimizu比较接近,而与另外2个种C . scarabaeicola Kobayasi和Phytocordyceps ninchukiospora C.H.Su & H.H.Wang则关系较远。另据Sung等[40]报道,应用这种方法分析蛹虫草、C. bifusispora O. E. Erikss.和粉被虫草(C.pruinosa Petch)等种类时,不同种类之间的蛋白结合图谱的相似性不同。Choi等[41]使用ITS片段的RFLP图谱区分了白僵菌[B.bassiana（Bals.-Criv） Vuill. ]、蝠虫草、Cscarabaeicola和Paecilomyces tenuipes（Peck） Samson等种类。

　　Park等[42]对10个虫草菌、12个拟青霉菌、3个白僵菌、2个绿僵菌和 1个被毛孢菌的材料进行了ITS序列分析，其中5个蛹虫草材料的序列几乎完全一致,而冬虫夏草和大团囊虫草聚在一起,并与蛹虫草处在2个不同的分支上。不过,Park等[42]所使用的冬虫夏草ITS序列显然与来自青藏高原的材料如参考文献[31,32,43]和本实验室数据(未发表)相差较大,其可靠性有待验证。刘作易等[31]采用ITS序列分析了13种虫草菌及一些相关的无性型菌种, 结果也显示蛹虫草与冬虫夏草关系较远,而粉被虫草、布氏虫草( C .brongniartii Shimazu)和蛹虫草关系密切, C brittlebankisoides Z.Y. Liu等、古尼虫草和霍克斯虫草( C . hawkesii Grey)形成1个分支,  冬虫夏草和多轴虫草、尼泊尔虫草具有相同或非常相似的序列,并且与C.robertsii （Hook.） Berk .、C.emeinsis  A. Y. Liu & Z. Q. liang、C. sobolifera  Berk.等聚在同一分支上。

　　根据现有的研究[11.12]，不同虫草种类之间的关系与它们的寄主有一定的相关性,但同一寄主上的不同虫草种类也可能关系较远。在Artjariyasripong等[11]根据rDNA大、小亚基部分序列构建的系统树上,寄生在鳞翅目昆虫上的蛹虫草和C. pseudomilitaris聚在一起,寄生在菌物上的头状虫草与C . intermedia S. Imai关系也较近。
 

　　使用RAPD方法研究冬虫夏草及其相关类群的结果目前还存在不一致的报道。张云武等[52]使用RAPD方法分析了采自云南西北部鉴定为阔孢虫草和冬虫夏草的样本(分别为8个和6个) ,并以蛹虫草作为外群,计算了这些样本之间的遗传距离,结果表明,冬虫夏草与阔孢虫草的样本完全相互分开,而且一些冬虫夏草样本与阔孢虫草样本间的遗传距离达到了蛹虫草与冬虫夏草样本的遗传距离,从而认为冬虫夏草与阔孢虫草之间的遗传差异较为明显,已经达到种级分化的水平。 然而,同一研究小组[53]的RAPD研究结果却表明, 青藏高原不同地区的冬虫夏草居群可分为不同亚种,而不是不同的种。

　　 1.3虫草菌遗传分化方面的研究

　　 在研究虫草属的种内遗传分化方面,RAPD标记分析是最常用的方法,ITS序列分析也有所采用。由于冬虫夏草的价值和分布的特殊性,其遗传分化问题特别引人关注。陈永久等[54]对来自青藏高原东部、北部和中部3个区域5个不同产地的13个冬虫夏草样本进行了分析,得出与分布区域相对应的3个组,并且显示不同区域样本间的遗传距离最大,而同一产地的样本间距离最小,同时群体的遗传结构还与纬度变化有关。陈永久等[53]在增加了样本,特别是青藏高原南部的材料后,进一步把冬虫夏草分为北部(为参考文献[54]报道中的东部和北部区域)、中部(与参考文[54]报道的中部一致)和南部3个地理类群,不同地理类群间存在明显的遗传分化,并指出南部地理群在形态上更接近于已经报道的阔孢虫草,北部地理群更类似于冬虫夏草,而中部类群介于两者之间。

 　　有关蛹虫草的遗传分化也有过报道, Sung等[55]用RAPD研究了72个采自韩国11个地点的菌种,但未能看出这些分离物之间的遗传关系。蛹虫草已有大量的人工栽培,其遗传分化问题很值得探讨。

　　1.4无性型与有性型的关系

　　分子生物学手段从遗传物质上揭示菌株的特性,在探讨菌物无性型与有性型的关系时不受其生活史不同阶段的影响,并在确定冬虫夏草、蛹虫草、C.bittlebankisoides和C.sobolifera等多个种类的无性型上已成为重要的方法[31,34，37，38，48，55-58]。

　　与 冬虫夏草相关的无性型已报道了多达22个名称,涉及11个属[59，60]。然而, ITS片段序列分析[32，34,49，58]和RAPD分析[38]等多个独立的研究结果都支持中国被毛孢为冬虫夏草的无性型。赵锦等[58]报道冬虫夏草与中国被毛孢ITS序列的相似性为97.8%,而与中国拟青霉(Paecilomyces s韩ensis Q. T . Chen et al. )、古尼拟青霉(P. gunii Z.Q.Iiang)的相似性则分别为72.6%和72.2%,从而认为冬虫夏草的无性型是中国被毛孢。王宁等[34]进行的ITS序列研究也表明,冬虫夏草与中国被毛孢序列之间的差异仅为2%。

　　陈月琴等[49]比较了4个冬虫夏草和2个中国被毛孢以及其他一些相关菌物的ITS序列,发现冬虫夏草与中国 被毛孢的序列遗传距离很小,两者之间与各自不同菌株之间的距离很相似,而与中国拟青霉以及医药网新闻