马和团队在开发了一种新的核壳蛋白比率荧光免疫分析方法

来源：纳米研究2022-08-25 11:42

研究组构建了一种基于硅FITC纳米粒子的新型比率荧光探针，结合荧光ELISA提高了检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的灵敏度和重现性。

截至2022年7月，由新型冠状病毒()引起的全球疫情已造成超过5亿人死亡，超过600万人死亡。新型冠状病毒前期对新冠肺炎疫情的有效防控具有重要意义。新型冠状病毒的检测方法主要分为三类：核酸、抗体和抗原检测。核酸检测的优点是灵敏度高，但需要昂贵的设备和专业的技术人员来操作。抗体检测简单、快速、技术要求低，但存在窗口期长、灵敏度和准确度有限等缺点。与上述两种检测方法相比，抗原检测具有方便、快速的优点，更适合新型冠状病毒的快速感染。然而，传统的抗原检测存在灵敏度低、假阴性高的问题。酶联分析(ELISA)方法简单成熟，技术要求低，在抗原检测中应用广泛。与比色ELISA相比，荧光ELISA具有更宽的动态范围和更高的灵敏度。

在过去的二十年中，用于生物应用的荧光纳米探针的发展一直是纳米生物学领域的研究热点。荧光硅纳米粒子具有高量子产率、优异的稳定性和低毒性，广泛应用于生物传感器的开发。然而，基于单发射峰的荧光生物传感器易受环境干扰、探针浓度波动和实验仪器不稳定的影响。为了解决这些问题，研究组构建了一种基于硅FITC纳米粒子的新型比率荧光探针，结合荧光酶联免疫吸附法，提高了检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的灵敏度和重现性。

最近，中国科学院深圳高级研究所马和中国南方科技大学第二附属医院合作，在《纳米研究》杂志上发表了一篇研究论文，题目是：基于si-FITC纳米探针内滤效应的核壳蛋白比率计量荧光免疫分析。

本研究中，马和团队采用合成前修饰的方法制备了一种新型比率荧光探针硅纳米粒子。该方法合成后不需要化学修饰，提高了探针的发光效率和稳定性。硅FITC纳米颗粒的同步荧光光谱中有两个明显的荧光峰，一个是位于381 nm的硅荧光峰，另一个是位于489 nm的FITC荧光峰。碱性磷酸酶是一种重要的水解酶，广泛存在于哺乳动物的体液和组织中。它可以通过去磷酸化作用除去生物分子如核酸和蛋白质中的磷酸基团。本研究利用ALP催化对硝基苯磷酸(pNPP)水解为对硝基苯(pNP)和硅FITC纳米颗粒对pNP对比度的内过滤效应(IFE)来实现硅FITC纳米颗粒对ALP的特异性猝灭响应。

在该检测系统中，硅FITC纳米颗粒的双峰荧光强度比的变化与碱性磷酸酶活性呈正相关。ALP作为ELISA中广泛使用的标记酶，可以介导新型冠状病毒N蛋白的检测，结果表明该检测方法的灵敏度比商用试剂盒高一个数量级。同时，将该方法应用于人血清中新型冠状病毒N蛋白的检测。在血清回收实验中，回收率为95.17-107.41%，表明该方法具有一定的应用潜力。

此外，将该方法应用于新型冠状病毒病毒感染的临床样本分析，结果表明该方法能够准确检测新型冠状病毒病毒感染的阳性样本和阴性样本，可为新型冠状病毒病毒感染的早期筛查提供有效的方法指导。该方法不仅提高了ELISA的检测灵敏度，而且拓宽了基于内滤效应的比值传感器的应用范围。

如图1所示，研究小组通过一锅水热法制备了比率荧光探针硅FITC纳米颗粒。该方法将APTES和FITC偶联起来，与APTES一起作为硅源，避免了合成后的修饰，提高了探针的发光效率和稳定性。在ALP介导的比率荧光ELISA传感系统中，通过形成固定化ALP的免疫复合物，可以将新型冠状病毒N的蛋白质含量转化为检测系统中的ALP含量。

研究小组使用350 V氙灯连续照射硅FITC纳米颗粒两个小时，并监测荧光强度的变化，以评估硅FITC纳米颗粒的光稳定性(图2A)。结果表明，由于硅涂层的保护，硅-FITC纳米颗粒中的硅和FITC具有更好的光稳定性。在不同的Tris缓冲液pH条件下，硅FITC纳米颗粒的两个峰的荧光强度比没有明显变化(图2B)。该团队还研究了体液中一些常见离子和生物分子对硅FITC纳米颗粒荧光的影响(图2C)。这些干扰物质(100 M)对硅FITC纳米颗粒的荧光几乎没有影响，证明硅FITC纳米颗粒具有很强的抗干扰能力。以上数据表明，硅FITC纳米粒子具有良好的光稳定性、pH稳定性和化学稳定性。

研究小组研究了ALP在硅-FITC纳米粒子探针上的特异性猝灭性能。结果表明，随着ALP浓度从0 U/L增加到200 u/L，硅FITC纳米粒子在389 nm处的荧光明显淬灭，而在481 nm处的荧光没有明显变化。表明系统中的ALP浓度可以通过比率荧光法检测(图3A)。当ALP浓度在0.5-20.0 U/L的范围内时，可以观察到在Si-FITC NPs探针的双峰荧光强度比((F389/F481))的差异和ALP浓度之间存在良好的线性关系(图3B)。碱性磷酸酶作为ELISA中广泛使用的标记酶，可以在检测系统中介导ELISA用于新型冠状病毒N蛋白的免疫分析。