中国科学家在肝癌早期筛查和诊断方面取得新突破

来源：奇点蛋糕2022-09-01 10336028

全球范围内，肝细胞癌(HCC)的发病率在肿瘤中排名第六，但其死亡率却排名第三[1]。

全球范围内，肝细胞癌(HCC)的发病率在肿瘤中排名第六，但其死亡率却排名第三[1]。肝癌预后差的主要原因是其起病隐匿，确诊时多为晚期。因此，早期发现可以为早期治疗赢得宝贵的时间窗，显著改善患者的预后。

肝癌的发病大多遵循肝炎-肝硬化-肝癌的三步模式。肝硬化患者是肝癌最重要的高危人群。肝硬化人群中肝癌的早期发现是肝癌早期筛查的重中之重。目前肝癌高危人群早期筛查的方法有肝脏超声检查和血清甲胎蛋白(AFP)监测，但敏感性不到70%，准确率不理想[2]。

因此，寻找灵敏度高、特异性强的新的肝癌标志物对于肝癌的预防和治疗非常重要。

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是细胞释放的纳米囊泡样体，内含脂质、核酸、蛋白质等内容物。它们具有组织来源和疾病特异性，因此它们具有成为生物标志物的潜力。而且，EVs出现在癌症早期的血液和体液中。通过液体活检从肿瘤中检测EVs以实现癌症的早期诊断是非常可行的。研究发现，基于EVs的lncRNA和mRNA可以区分早期肝癌和肝硬化[3]。

近日，美国加州大学洛杉矶分校(UCLA)的曾教授和朱亚珍教授与洛杉矶Cedar-Sinai医学中心的临床团队一起，从早期肝癌和肝硬化患者的外周血中分离出EV，开发并优化了HCC特异性EV表面蛋白的检测方法，从而建立了全新的HCC早期筛查模型，区分早期肝癌和肝硬化的准确率超过93%(AUC 0.93)，检测性能优异[4]该研究成果已在线发表在肝脏病学顶级期刊《Hepatology》上。

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疾病检测模型的诊断性能取决于标志物的特异性。为了找到针对HCC EVs的适当蛋白质标记，研究人员首先在HCC组织、来自HCC细胞系的EVs和来自HCC患者外周血的EVs中验证了这些标记。

肿瘤EVs的蛋白往往与肿瘤细胞的蛋白呈正相关。先前的研究发现EpCAM、CD147、GPC3和ASGPR1在HCC中高度表达[5]。因此，研究人员选择了这四种蛋白作为检测HCC EVs的候选标记。

组织微阵列的结果显示，高达99.7%的HCC患者至少一种标志物阳性，其中24.6%的患者所有四种标志物阳性，47.7%的患者任意三种标志物阳性，24.6%的患者任意两种标志物阳性。这四种蛋白标志物在HCC组织中的表达是互补的，这表明这四种蛋白作为标志物的组合，在HCC的诊断中可能具有极好的优势。

免疫组织化学(图a)检测包含708个HCC病例的组织芯片上四种蛋白标记物EpCAM、CD147、GPC3和ASGPR1的表达；HCC组织中饼图(图B)和直方图(图C)中蛋白标志物的阳性表达率；免疫印迹(图d)检测候选HCC EVs表面蛋白标记的表达：HepG2、Hep3B和Huh-7是人HCC细胞系。作为实验组，MIHA为永生化人肝细胞系，原代人肝细胞为人肝细胞。作为对照组，BSA为胎牛血清白蛋白溶液，并作为空白对照组。

同时，研究人员验证了候选蛋白标记在HCC细胞系EVs中的表达。免疫印迹结果显示，这4种蛋白在HCC细胞系的EVs中均有表达，且表达水平远高于正常肝细胞，提示它们可作为检测HCC EVs的特异性标记。

Hccvs不仅表达四种特异性蛋白标记物，即EpCAM、CD147、GPC3和ASGPR1，还表达两种通用生物标记物，即CD63和CD9，它们通常由EVs表达。根据特异性和通用标记，研究人员将HCC EVs分为8个亚组，包括EpCAM CD63 HCC EVs和EpCAM

然后，研究人员招募了45名早期HCC患者和61名匹配的肝硬化患者组成训练队列，并检测了训练队列中HCC EVs亚群的表达。结果显示，早期HCC组8个HCC EVs亚组的含量明显高于肝硬化组，尤其是以CD63为基础的4个HCC EVs亚组。

研究人员构建了逻辑回归模型来分析HCC EVs亚群的诊断性能。ROC曲线显示，在8个亚组中，基于CD63的亚组诊断效率普遍高于基于CD9的亚组，其中EPCAM CD63 HCC EVs、CD147 CD63 HCC EVs和GPC3 CD63 HCC EVs与早期HCC高度相关。

因此，研究人员整合了这三个亚组来构建HCC的早期诊断模型。

，并根据首字母缩写将模型命名为HCC EV ECG评分。在训练队列中，HCC EV ECG评分对早期HCC和肝硬化的鉴别表现出极高的准确性，AUC为0.95；在评分=-0.4的最佳cut-off值处，对早期HCC检测的敏感性达到91%，特异性达到90%，阳性预测值和阴性预测值分别达到87%和93%！

随后，研究人员收集35名早期HCC患者和37名匹配的肝硬化患者组成验证队列，在验证队列中对HCC EV ECG评分的检测性能进行验证。结果显示，HCC EV ECG评分区分早期HCC和肝硬化的性能依然优秀，AUC为0.93，敏感性为91%，特异性为81%。

研究人员又比较了早期HCC和中晚期HCC、、前列腺癌及甲状腺癌的HCC EV ECG评分，发现HCC患者的HCC EV ECG评分显著高于其他癌症患者，证实了HCC EV ECG评分对HCC，而非其他癌症的诊断特异性。

最后，研究人员评价了HCC EV评分在HCC不同病因亚组和危险分层中的诊断性能。HCC EV评分在病毒性肝炎引起的HCC患者中AUC达到0.95，在非病毒性病因HCC患者中的AUC为0.94，都表现出了识别早期HCC区分肝硬化的卓越检测能力；在米兰标准内的早期HCC患者中，HCC EV ECG评分也表现出色，AUC为0.93，90%的敏感性下特异性达到87%。

就病因而言，除病毒性肝炎外，HCC还存在酒精性肝病等非病毒性因素，不同病因的HCC在临床特征和预后等方面也不尽相同[6]。就治疗而言，米兰标准是当前公认的肝移植适应证，因此识别米兰标准内的早期HCC也有一定临床价值。

综上所述，研究人员通过分离外周血EVs，检测HCC EV表面蛋白，基于三种HCC EV亚群，开发出一个早期HCC的检测模型，并在早期HCC和肝硬化患者中彰显出精准识别HCC的卓越性能，简便，准确，快速，有望提高HCC的早筛效率，改善早期HCC患者的预后。

然而本研究也还存在一些局限性，如入组的早期HCC和肝硬化患者例数过少，而且并未纳入健康人群，可能会让这个早筛模型的应用受到限制。另外，在实验材料的选择上本研究也不尽完善，比如在HCC组织芯片上对候选蛋白标志物进行表达验证时，还应该同时在肝硬化和正常肝组织上进行检测，以作为对照。期待后续的前瞻性临床研究，进一步验证HCC EV评分的实用价值。

参考文献：

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi:10.3322/caac.21660

[2] Marrero JA, Kulik LM, Sirlin CB, et al. Diagnosis, Staging, and Management of Hepatocellular Carcinoma: 2018 Practice Guidance by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 2018;68(2):723-750. doi:10.1002/hep.29913

[3] Sun N, Lee YT, Zhang RY, et al. Purification of HCC-specific extracellular vesicles on nanosubstrates for early HCC detection by digital scoring. Nat Commun. 2020;11(1):4489. Published 2020 Sep 7. doi:10.1038/s41467-020-18311-0

[4] Sun N, Zhang C, Lee YT, et al. HCC EV ECG Score: An Extracellular Vesicle-based Protein Assay for Detection of Early-Stage Hepatocellular Carcinoma [published online ahead of print, 2022 Jul 31]. Hepatology. 2022;10.1002/hep.32692. doi:10.1002/hep.32692

[5] Court CM, Hou S, Winograd P, et al. A novel multimarker assay for the phenotypic profiling of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. Liver Transpl. 2018;24(7):946-960. doi:10.1002/lt.25062

[6] Karim MA, Singal AG, Kum HC, et al. Clinical Characteristics and Outcomes of Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in the United States [published online ahead of print, 2022 Mar 17]. Clin Gastroenterol Hepatol. 2022;S1542-3565(22)00284-1. doi:10.1016/j.cgh.2022.03.010

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