Nature Communications:开发出一种由高性能基因编码的新型环磷酸腺苷荧光探针

近日，中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与健康工程研究所生物医学光学与分子影像研究中心研究员储君在《自然-通讯》(自然通讯)上，发表了题为“一种用于体内cAMP成像的高性能基因编码荧光指示剂”的研究论文，报道了高性能基因编码的环磷酸腺苷(cAMP)荧光探针及其应用。

CAMP是细胞内关键的第二信使，能够整合来自多种G蛋白偶联受体(GPCR)的信号，在学习记忆、药物成瘾、运动控制、癌症、代谢等方面发挥重要作用。活细胞和活体内cAMP分子浓度变化的高时空分辨率荧光成像是分析cAMP信号通路及其生物学功能的重要基础。因此，开发高灵敏度的cAMP荧光探针成为研究复杂生物过程的关键。与非基因编码探针(染料和材料)相比，基因编码探针具有低毒、低背景、可遗传、定位特定细胞亚结构或特定细胞等优势，在生命科学基础研究中具有优势。然而，现有的由50多个基因编码的cAMP荧光探针要么灵敏度低(最大荧光变化仅为1.5倍)，要么荧光亮度较暗，难以监测体内微弱的内源性cAMP变化，限制了生理病理条件下cAMP分子调控机制和功能的研究。

为了开发一种适用于体内检测的高灵敏探针，研究人员将环状重排绿色荧光蛋白(cpGFP)插入细菌MlotiK1通道的cAMP结合域(mlCNBD)。通过插入位点的选择、连接肽的优化、荧光蛋白和传感模块的优化，获得了一种亮度高、灵敏度高、亲和力合适、响应速度快的高性能基因编码cAMP绿色荧光探针(G-Flamp1)。晶体结构表明，G-Flamp1探针的连接肽具有独特的结构：一个连接肽是非常刚性的链结构，这在其他已知晶体结构的环状重排荧光蛋白探针中是不存在的，这为开发其他高性能探针提供了新的思路和方法。

在体外实验中，有和没有cAMP的G-Flamp1具有不同的发色团环境。G-Flamp1在450 nm(单光子)或900-920 nm(双光子)激发时动态范围最大，即F/F0约为13。G-Flamp1对cAMP有中等亲和力，其解离常数Kd为2.17 M.G-Flamp1能以亚秒的时间分辨率检测cAMP的动态变化。在培养的细胞中，探针均匀分布在细胞质和细胞核中，背景荧光亮度介于同类探针cAMPr和Flamindo2之间。G-Flamp1探针在活细胞中的动态范围为12倍，是为数不多的动态范围超过10倍的荧光蛋白探针。同时，该探针具有良好的特异性和可逆性(图1)。

将G-Flamp1探针应用于模式生物果蝇。果蝇脑蕈形体Kenyon细胞中的CAMP信号通路在气味相关记忆中起着关键作用。首先，获得了在Kenyon细胞中表达G-Flamp1探针的转基因果蝇。然后，双光子成像显示，当果蝇受到气味或电击刺激时，蘑菇体的不同亚区呈现出cAMP信号在时间和空间上的不同变化(图2)，提示不同亚区可能在联想学习中发挥相对独立的作用。

为了验证G-Flamp1探针在活体动物中检测cAMP动态变化的实用性，研究人员利用腺相关病毒在小鼠运动皮层中共表达绿色G-Flamp1探针和红色jRGECO1a钙探针。在体双光子成像揭示了跑步过程中细胞特异性cAMP信号，与钙信号无明显相关性。这反映了运动期间小鼠大脑皮层M1神经元反应的异质性。

研究人员将G-Flamp1探针表达在小鼠伏隔核(NAc)深部脑区，用光纤记录听觉巴甫洛夫条件反射任务过程中该脑区cAMP信号的变化。结果表明，随着训练的熟练程度，当小鼠受到奖励时，cAMP信号的振幅降低，但当它们听到相应的音频信号时，cAMP信号的振幅增加。这种特征类似于多巴胺信号，提示多巴胺释放引起cAMP信号。综上所述，G-Flamp1探针的高信噪比和高时间分辨率可以高灵敏度地检测活体小鼠内源性cAMP信号的动态变化。

本研究开发了适用于活体检测的cAMP荧光探针，初步揭示了cAMP信号在果蝇、小鼠等模式生物特定神经元中的变化规律，为进一步解释cAMP信号的调控和功能奠定了基础。结合高含量药物筛选平台，该探针将尝试应用于GPCR受体的药物筛选，以期发现更多具有临床价值的GPCR药物。

图一。g-flamp1探针在体外和培养细胞中的特性