引导编辑和基础编辑领域的一系列突破性研究进展

来源：原序列生物2022-04-11 11:13

这一研究成果不仅为环状RNA的研究提供了新的思路，也拓展了base editor在生命科学研究领域的应用。

近年来，基因编辑技术发展迅速。基于CRISPR/Cas系统的新型基因编辑技术，以其高效、无DNA双链断裂、无需供体DNA等优势，正逐渐成为基因编辑领域的明星，在生物医学、畜牧业、农业等领域有着广泛的应用场景。

目前，根据编辑原理的不同，新的编辑系统主要分为基本编辑系统和主要编辑系统。但目前PE介导的DNA插入片段较短、在许多疾病相关位点编辑效率较低、在人体细胞中存在脱靶效应等问题制约了其临床应用和推广，BE在更广泛研究领域的创新应用有待探索。

为了开发更高效、安全、可靠的碱基基因编辑技术，上海科技大学教授、杨力教授、武汉大学医学研究所殷浩教授、上海科技大学杨贝教授等研究团队，进行了一系列的研究。在测试现有制导编辑技术的安全性、提高制导编辑系统的编辑能效、拓展基地编辑系统的应用范围等方面取得突破性进展。真正将疾病相关目标中的引导编辑的编辑效率提升到了医学的水平，为相关领域的临床应用提供了坚实的技术基础。

检查指南编辑系统的安全性。

编辑系统(PE)的工作原理是将CRISPR系统中的sgRNA转化为pegRNA(prime editing guide RNA)，它不仅含有sgRNA中的靶向DNA结合区域，还携带引物结合位点(primer binding site，PBS)区域和逆转录模板(RTT，逆转录模板)可以与逆转录酶(RT)结合，将pegRNA中的RTT序列写入靶向位点的DNA序列。2019年，杨力教授、杨贝教授和陈嘉教授在Cell期刊上发表专题评论，介绍了指导编辑系统的工作原理。

然而，PE系统的安全性仍然缺乏全面的证明。虽然有报道称PE系统仅产生少数pegRNA依赖性脱靶突变；但是否会产生另一种更严重的随机突变，即pegRNA非依赖性脱靶突变，还有待考证，这种突变与pegRNA序列无关，很难预测。

2022年3月14日，陈嘉教授和杨力教授与上海科技大学生命科学与技术学院黄行许教授合作，在CRISPR期刊在线发表了题为《Prime编辑指南RNA独立脱靶效应的基因组和转录分析》的研究论文。

本文建立了一种在细胞水平上检测和分析PE系统在全基因组和全转录组脱靶效应的方法，证实了PE3逆转录酶在编辑过程中的高度特异性。

为了全面有效地评价PE的脱靶效应，研究人员首先构建了一个293FT细胞背景突变数极低的细胞系293 ft 3-/-，用PE3、hA3A-BE3和Cas9三种不同的编辑器进行编辑，然后检测这三种编辑器编辑的单克隆细胞的突变数。所有实验都是在全基因组和转录组中进行的。(图1A)

在基于基因组和转录组数据对端粒完整性、内源性逆转录元件的活性、选择性剪接事件的发生和基因表达模式的变化进行综合比较和分析后，研究人员发现PE3在靶位点高效(图1B)，但在全基因组(图1C)和全转录组(图1D)中没有检测到PE3产生的pegRNA的独立脱靶效应。因此，证明了PE3系统的高度特异性(高等，CRISPR J2022)。

图1:在全基因组和转录组水平上，在PE3中没有检测到非pegRNA依赖性脱靶突变。

a)通过在细胞水平检测编辑的单克隆细胞来分析PE是否有脱靶突变的方法的模式图。

B)目标站点上B)PE3的编辑效率。

c)在整个基因组中没有检测到PE3的脱靶突变。

这些结果为PE3在高精度基因编辑中的应用提供了理论基础。

编辑系统的升级改造

为了提高PE系统的编辑效率，课题组还做了进一步的探索。

2022年2月28日，武汉大学医学研究院殷浩教授和张颖教授在《自然方法》在线发表了题为《无DNA供体的大DNA片段高效靶向插入》的最新研究进展。研究团队开发了一个新的面向编辑的系统，GRAND editing。通过引入一对pegRNAs并巧妙设计，实现了在没有DNA供体的情况下将长序列片段准确插入基因组DNA的新策略。

本研究利用一对特殊设计的peg RNA构建了一个新的定向编辑系统，即Grand Editing(基因组编辑，通过RTTs进行的基因组编辑，这些RTTs在duo peg RNA中彼此部分对齐，但与靶序列不同源),以实现靶片段的定向插入。插入片段的长度从PE3介导的44 bp扩展到GRANDediting介导的1000 bp，大大扩展了导向编辑系统在定向插入片段编辑中的应用范围。

配对pegRNAs的3-末端携带的专门设计的逆转录模板含有一个碱基互补配对区，两个RTT与基因组的靶位点之间没有同源序列。当RT酶通过pegRNA 3末端的引物结合位点开始逆转录时，产生两对互补的单链DNA，然后产生稳定的双链DNA结构。这种编辑链在与原始基因组链的竞争中占有优势，从而实现外源片段的高效插入。同时，由于GRAND editing中的逆转录模板不需要与基因组同源配对，因此可以插入具有相同活瓣长度的更长的外源片段(图2)。

图2:靶向插入2:PE3的DNA片段(左)和大编辑(右)的示意图

研究团队利用GRAND editing系统成功插入了bsd基因，并通过基因插入对EGFP基因进行了部分缺失基因片段的补充，实现了内源多位点的高效靶向DNA插入，其编辑中副产物比例极低。同时证实了GRAND editing可以实现在各种细胞系的多个位点和非分裂细胞中插入长序列。

GRAND editing系统为研究人员提供了研究基因功能和分子生物学的新方法，也极大地拓展了遗传病和罕见病基因治疗的思路以及相关药物和治疗管道的开发。

除了增加PE系统目标位点插入的DNA片段长度，研究团队还针对编辑效率极低的位点创新性地升级了PE系统。

2022年3月29日，上海市第一人民医院教授、杨力教授与教授合作，在Nature Communications Journal上发表了一篇名为《Prime编辑指南RNA非依赖性脱靶效应的基因组和转录分析》的在线出版物。在ime编辑器的研究论文中，通过定期引入同义突变和pegRNA骨架优化，开发了新的面向编辑系统sPE和aPE。优化的sPE系统将碱基转换效率平均提高了353倍(高达4976倍)，优化的aPE系统将碱基插入/缺失效率平均提高了2.77倍(高达10.6倍)。

针对PE介导的单碱基转换，研究人员通过在pegRNA的逆转录模板中有规律地引入同义突变，开发出SpegRNA，并将其与PE3系统整合构建sPE3。发现当引入一个或两个同义突变，并且它们位于位置1、5、6或位置2、5、3和6时，可以获得最有效的spegRNA。优化后的spegRNA可以将碱基转换效率平均提高353倍(最高可达4976倍)，在原版本PE3没有明显编辑的站点(编辑效率不到3%)将编辑效率提高到40%到80%(图3)。

图3: Spegrna可以介导更有效的碱基转换。

鉴于PE3介导的碱基的精确插入/缺失，研究人员在分析pegRNA的骨架后，将发夹结构中的G/A转化为C/G碱基对，以提高pegRNA的稳定性，从而建立apegRNA，并将其与PE3系统整合构建aPE3。检测后，优化的apegRNA将PE3介导的碱基插入/缺失效率平均提高了2.77倍(高达10.6倍)(图4)。

图4: Apegrna可以介导更有效的碱基插入/缺失。

同时，spegRNA和apegRNA的结合可以进一步提高碱基转换和插入/缺失的效率。spegRNA和apegRNA还可以与PE5系统(sPE5和aPE5)集成，提高PE5的编辑效率(李等，Nat Commun2022)。

基础编辑系统的创新应用

除了PE系统研发的系列成果，研究团队多年来对BE系统进行了深入的研究和开发。BE系统主要由sgRNA和碱基编辑器组成，其中碱基编辑器一般由修饰的Cas9蛋白(DCA9或NCA9)、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂组成。通过与靶位点的互补配对，sgRNA指导碱基编辑器与靶位点结合。

许多环状RNA(circrna)是通过前体mrna外显子的反向剪接产生的，通常与同源线性RNA共表达。由于基因之间的序列重叠，环状RNA没有特定的敲除方法。

2022年1月10日，杨力教授、陈嘉教授与中国科学院分子细胞创新卓越中心(原上海生化细胞研究所)研究员陈玲玲合作，《基因组生物学杂志》在线发表了通过碱基编辑环状外显子反向剪接位点敲除环状RNA的研究进展，报道了利用hA3A-BE碱基编辑平台专利技术在基因组水平敲除环状RNA的新策略。

该研究成果的成功发表，得益于研究团队在碱基编辑和循环RNA领域的独特优势，紧密结合各个实验室的研究积累。基于反向剪接位点与经典剪接位点(5 -AGgt - agGT-3-3)一致的特点，利用碱基编辑器进行单碱基突变，实现了基因组水平的环状RNA敲除新方法(图5)。

由于环状RNA与其同源的线性mRNA在一级序列上的一致性，当这些共享的剪接位点被CBE(反向互补链的C到T编辑)或ABE(编码链的A到G编辑)碱基编辑器改变时，环状RNA与其对应的线性RNA同时被抑制，因此不可能简单地用碱基编辑器敲除环状RNA。

为了实现环状RNA的特异性敲除，应该只设计环状RNA中外显子反向剪接位点的突变。通过计算、分析和鉴定，研究人员发现了一类特殊的新型环状RNA分子，其中含有仅存在于环状RNA中的外显子，并利用碱基编辑器对相应的反向剪接位点进行了突变，从而实现了环状RNA的特异性敲除(图5)。利用这种方法，研究人员还在293FT发现了一种新的具有影响细胞增殖功能的环状RNA分子。

图5:通过编辑环状RNA特异性外显子的反向剪接位点敲除环状RNA

这一研究成果不仅为环状RNA的研究提供了新的思路，也拓展了base editor在生命科学研究领域的应用。

上海科技大学生命科学与技术学院陈嘉教授、武汉大学生物医学科学院杨力教授、武汉大学医学研究所殷浩教授、上海科技大学免疫化学研究所杨贝教授，多年来深耕于基因编辑、DNA损伤修复、RNA生物学、药物传递、疾病动物模型、蛋白质工程等生物技术领域。研究团队开发了全球先进的基地编辑系统，拥有10多项技术专利和目标专利，覆盖全球15个国家和地区。目前，该团队基于新的碱基编辑系统创造了多种疗法，比传统的基因编辑疗法更安全、更可靠、更高效，特别是在控制脱靶效应的安全性和体内编辑效率方面具有显著优势。相关研究已在《自然生物技术》、《自然细胞生物学》、《自然方法》、《自然结构分子生物学》、《自然生物医学工程》、《自然通讯》、《基因组生物学》等国际学术期刊上发表。受到了业界的广泛关注。

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